{"id":64,"date":"2015-04-02T10:38:18","date_gmt":"2015-04-02T08:38:18","guid":{"rendered":"https:\/\/sperimentando.com\/?p=64"},"modified":"2015-04-10T20:23:50","modified_gmt":"2015-04-10T18:23:50","slug":"introduzione-alla-bioinformatica-le-sequenze-di-dna-sono-stringhe-di-caratteri","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/sperimentando.com\/?p=64","title":{"rendered":"Introduzione alla bioinformatica: le sequenze di DNA sono stringhe di caratteri &#8211; versione per studenti con preparazione in informatica"},"content":{"rendered":"<div id=\"attachment_72\" style=\"width: 187px\" class=\"wp-caption alignright\"><a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNA_Overview-409x1024.png\" data-fslightbox=\"gallery1\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" aria-describedby=\"caption-attachment-72\" class=\" wp-image-72\" src=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNA_Overview-409x1024-409x1024.png\" alt=\"Immagine realizzata da Michael Str\u00f6ck e rilasciata con licenza libera http:\/\/en.wikipedia.org\/wiki\/File:DNA_Overview.png\" width=\"177\" height=\"443\" srcset=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNA_Overview-409x1024.png 409w, https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNA_Overview-409x1024-120x300.png 120w\" sizes=\"auto, (max-width: 177px) 100vw, 177px\" \/><\/a><p id=\"caption-attachment-72\" class=\"wp-caption-text\">Immagine realizzata da Michael Str\u00f6ck e rilasciata con licenza libera http:\/\/en.wikipedia.org\/wiki\/File:DNA_Overview.png<\/p><\/div>\n<p>Il DNA \u00e8 un polimero organico costituito da monomeri chiamati nucleotidi. Tutti i nucleotidi sono costituiti da tre componenti fondamentali: un gruppo fosfato, un deossiribosio\u00a0e una base azotata. Il gruppo fosfato ed il ribosio si legano a formare lo scheletro della doppia elica, mentre i pioli sono costituiti da coppie di basi azotate. Le basi azotate che possono essere utilizzate nella formazione dei nucleotidi da incorporare nella molecola di DNA sono quattro: adenina (A),\u00a0guanina(G), citosina (C) e timina (T).<\/p>\n<p>L&#8217;ordine nella disposizione sequenziale dei nucleotidi costituisce l&#8217;informazione genetica.<\/p>\n<p>Possiamo in effetti rappresentare questa informazione come una sequenza di lettere, o stringa di caratteri. Le stringhe di caratteri che otteniamo possono essere analizzate in vari modi e restituire informazioni con un significato biologico.<\/p>\n<h2>Il terminale<\/h2>\n<p>Iniziamo a familiarizzare con questa idea eseguendo dei semplici comandi su un file che contiene le sequenze nucleotidiche di alcuni geni.<\/p>\n<p>Per prima cosa stampate a video il nome della directory in cui vi trovate: il comando\u00a0<strong>pwd <\/strong>(print working directory) vi consente di farlo<\/p>\n<p>Quindi spostatevi nella vostra home con il comando<strong> cd ~ <\/strong><\/p>\n<p>Controllate utilizzando di nuovo<strong> pwd <\/strong>di avere eseguito il comando con successo e di essere in effetti nella home<\/p>\n<p>A\u00a0questo punto stampate a video la lista dei files contenuti nella vostra home con il comando\u00a0<strong>ls<\/strong>\u00a0(list)<\/p>\n<p>Nella home dovreste aver trovato la cartella\u00a0&#8220;esercitazione_bio&#8221;, stampate a video la lista dei files presenti in quella cartella digitando il comando\u00a0<strong>ls esercitazione_bio (ricordavi che il <a title=\"tab autocompletamento in inglese\" href=\"http:\/\/en.wikipedia.org\/wiki\/Command-line_completion\" target=\"_blank\">TAB \u00e8 un potentissimo strumento<\/a> di aiuto!!!)<\/strong><\/p>\n<p>Ora spostatevi nella cartella dell&#8217;esercitazione utilizzando\u00a0scrivendo\u00a0<strong>cd eser <\/strong>e poi premendo<strong> TAB<\/strong><\/p>\n<p>Iniziamo a scoprire come sono fatti i files contenenti le sequenze di DNA stampandone a video il contenuto: <strong>cat <a title=\"sequenze.fasta\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/sequenze.txt\">sequenze.fasta<\/a><\/strong><\/p>\n<p>Se il file \u00e8 molto lungo e quindi facciamo fatica a leggerlo possiamo iniziare stampando a video solo le prime righe, ad esempio digitando: <strong>head -n 20\u00a0sequenze<strong>.fasta<\/strong><\/strong><\/p>\n<p>Un comando simile ci consente di stampare solo le ultime righe del file: <strong>tail -n 10 sequenze<strong>.fasta<\/strong><\/strong><\/p>\n<h2>Il file contenente le sequenze di DNA<\/h2>\n<p>Come avrete notato osservando con attenzione\u00a0le vostre\u00a0stampe a video, il\u00a0file &#8220;sequenze&#8221; ha\u00a0la seguente\u00a0struttura: all&#8217;inizio della riga c&#8217;\u00e8 un simbolo di maggiore seguito dal nome della sequenza;\u00a0poi c&#8217;\u00e8 un accapo; a partire dalla nuova riga c&#8217;\u00e8 una lunga fila di lettere a, c, g, t senza spazi disposta su pi\u00f9 righe\u00a0che rappresenta\u00a0appunto la sequenza di DNA.\u00a0Sapreste dire quante sequenze di DNA distinte identificate da un nome ci sono in quel file?<\/p>\n<p>Con il comando\u00a0<strong>grep &#8220;&gt;&#8221;\u00a0sequenze<strong>.fasta<\/strong> <\/strong>stampate a video tutte le righe in cui \u00e8\u00a0presente\u00a0il simbolo &#8220;&gt;&#8221; (grep \u00e8 un comando molto utile con le sequenze di DNA, vale la pena approfondire)<\/p>\n<p>E ora per sapere quante sono cosa fate, le contate con il dito dal video? mah no, potete lanciare due comandi in sequenza in questo modo:\u00a0<strong>grep &#8220;&gt;&#8221;\u00a0sequenze<strong>.fasta<\/strong> | wc -l\u00a0<\/strong><\/p>\n<p>Per salvare il risultato che avete ottenuto in un file, basta direzionare il risultato del vostro comando in un file\u00a0<strong>grep &#8220;&gt;&#8221;\u00a0sequenze<strong>.fasta<\/strong> | wc -l &gt; numero_sequenze.txt<\/strong><\/p>\n<h2>Il nostro esercizio di oggi: utilizziamo le sequenze di DNA per capire cosa \u00e8 successo ai nostri pazienti!<\/h2>\n<h3>Cosa \u00e8 successo<\/h3>\n<p>&nbsp;<\/p>\n<p><iframe loading=\"lazy\" src=\"\/\/www.youtube.com\/embed\/WoNso1JnL5Y\" width=\"560\" height=\"315\" frameborder=\"0\" allowfullscreen=\"allowfullscreen\"><\/iframe><\/p>\n<p>Nella citt\u00e0 di New York si stanno verificando una serie di casi di\u00a0<a title=\"pagina wikipidia riguardante la tubercolosi\" href=\"http:\/\/it.wikipedia.org\/wiki\/Tubercolosi\" target=\"_blank\">tubercolosi<\/a>. Alcuni\u00a0malati vengono ricoverati\u00a0nell&#8217;ospedale dove lavora un vostro amico medico, il quale tratta i pazienti con l&#8217;antibiotico Rifampicina. Mentre molti dei pazienti mostrano immediatamente segni di miglioramento alcuni non sembrano invece rispondere al farmaco. Per capire la ragione del problema e riuscire a curare i pazienti che peggiorano invece di migliorare\u00a0il vostro amico contatta il servizio di microbiologia dell&#8217;ospedale e gli consegna i campioni prelevati da 5 pazienti che non rispondono all&#8217;antibiotico e da 5 pazienti che invece stanno rispondendo alle cure. Nel laboratorio di microbiologia i batteri che infettano ciascuno dei pazienti vengono coltivati e testati per vedere se sopravvivono all&#8217;antibiotico. In effetti i batteri che infettano i 5 pazienti che non rispondono alle cure proliferano in coltura nonostante la presenza dell&#8217;antibiotico, mentre quelli prelevati dai pazienti in via di miglioramento non sopravvivono in coltura in seguito alla somministrazione dell&#8217;antibiotico.<\/p>\n<p>Da 2 colture batteriche (una di un paziente che risponde all&#8217;antibiotico e una di un paziente che non risponde) viene estratto il DNA e ne viene determinata la sequenza al fine di indagare meglio questo comportamento.<\/p>\n<p>Le 2 sequenze ottenute vengono inviate proprio a voi,\u00a0che sapete programmare, per vedere se da quelle stringhe di caratteri si riescano ad estrapolare delle informazioni utili. Le sequenze ottenute durante questa indagine si trovano in ciascuna delle vostre <strong>home<\/strong> nella cartella <strong>esercitazione_bio<\/strong> ed il nome dei file \u00e8 <a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_sensibile_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_sensibile<\/a> e <a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_resistente_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_resistente<\/a><a title=\"file contenente le sequenze batteriche\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2014\/11\/DNAtubercolosi.txt\" target=\"_blank\"><strong>\u00a0<\/strong><\/a>(li dovreste aver visti gi\u00e0 prima quando avete fatto <strong>ls<\/strong> all&#8217;interno di questa cartella)<\/p>\n<p>Ripetete pure le operazioni fatte prima sul file\u00a0<strong><a title=\"sequenze.fasta\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/sequenze.txt\">sequenze.fasta<\/a><\/strong>\u00a0e vedrete che questi due files hanno qualcosa di diverso, cosa?<\/p>\n<h3>Geni e Proteine<\/h3>\n<p>I <a title=\"Gene wikipedia\" href=\"http:\/\/it.wikipedia.org\/wiki\/Gene\" target=\"_blank\">geni<\/a>\u00a0sono porzioni di\u00a0DNA\u00a0che contengono tutte le informazioni necessarie per la produzione di una <a class=\"mw-redirect\" title=\"Proteina wikipedia\" href=\"http:\/\/it.wikipedia.org\/wiki\/Proteina\" target=\"_blank\">proteina<\/a>.\u00a0Hanno un sito di inizio e un sito di fine. Il sito di inizio \u00e8 preceduto da un <a title=\"promotore wikipedia\" href=\"http:\/\/it.wikipedia.org\/wiki\/Promotore_(biologia)\" target=\"_blank\">promotore<\/a>. Il gene viene\u00a0<a title=\"Sintesi proteica wikipedia\" href=\"http:\/\/it.wikipedia.org\/wiki\/Sintesi_proteica\" target=\"_blank\">tradotto<\/a> in proteina. La proteina esegue una o pi\u00f9 funzioni.<\/p>\n<h3>Riusciamo\u00a0ad\u00a0associare qualche funzione alla stringa di caratteri che abbiamo ottenuto dal sequenziamento?<\/h3>\n<ol>\n<li>Sapreste scrivere un programma che identifichi un <strong>promotore<\/strong> e\u00a0l&#8217;<strong>inizio di un gene<\/strong>\u00a0all&#8217;interno di una sequenza?\u00a0Se ricordate le lezioni di biologia ci aspettiamo che un promotore batterico abbia una sequenza uguale a TTGACA 35 basi prima del sito di inizio della trascrizione ed una sequenza\u00a0uguale a TATAAT\u00a010\u00a0basi prima del sito di inizio della trascrizione. La struttura \u00e8 quindi la seguente: \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0<strong>TTGACA- 19 nucleotidi -TATAAT\u00a0&#8211; 10 nucleotidi &#8211; sito di inizio trascrizione<\/strong><\/li>\n<li>Ora passate\u00a0al vostro programma i due file\u00a0<a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_sensibile_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_sensibile<\/a> e <a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_resistente_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_resistente<\/a><strong><a title=\"file contenente le sequenze batteriche\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2014\/11\/DNAtubercolosi.txt\" target=\"_blank\">\u00a0<\/a><\/strong>e per ciascuno stampate\u00a0in un file le eventuali coordinate delle sequenze promotoriali e del sito di inizio del gene. \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u00a0 Ci sono geni all&#8217;interno delle sequenze? Ci sono in tutte e due i files o solo in uno dei due?<\/li>\n<\/ol>\n<h3>Cosa hanno di diverso le sequenze dei batteri che infettano i pazienti che non rispondono alle cure?<\/h3>\n<ol>\n<li>Sapreste scrivere un programma che confronti le due sequenze (<a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_sensibile_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_sensibile<\/a> e <a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_resistente_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_resistente<\/a>) e restituisca una lista delle differenze e la posizione di queste differenze all&#8217;interno delle sequenze?<\/li>\n<li>Se avete trovato differenze, dove si trovano? All&#8217;interno di un gene, di una regione promotoriale o di una regione a cui non avete attribuito alcuna funzione?<\/li>\n<\/ol>\n<p><em><strong>(Solo per chi \u00e8 superveloce ed ha finito di fare tutto in 2 ore<\/strong><\/em><\/p>\n<p><em>Incollate uno per volta il contenuto dei file\u00a0<a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_sensibile_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_sensibile<\/a> e <a href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/DNAtubercolosi_resistente_nospazi.txt\" target=\"_blank\">DNAtubercolosi_resistente<\/a><strong><a title=\"file contenente le sequenze batteriche\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/blog\/wp-content\/uploads\/2014\/11\/DNAtubercolosi.txt\" target=\"_blank\">\u00a0<\/a><\/strong>nella finestra di input del <a href=\"http:\/\/www.bioinformatics.org\/sms2\/translate.html\" target=\"_blank\">programma che si trova a questo link<\/a>\u00a0otterrete la traduzione in proteina dei vostri eventuali geni di partenza. Scegliete l&#8217;opzione: translate in <strong>reading frame 2 <\/strong>on the<strong> direct <\/strong>strand. <\/em><\/p>\n<p><em>Copiate su un file di testo la sequenza proteica ottenuta da ciascuno dei due files di partenza e salvateli come PROTEINA<em>tubercolosi_sensibile <\/em><\/em>e\u00a0<em>PROTEINA<em>tubercolosi_resistente.<\/em><\/em><\/p>\n<p><em>Potete ora far girare il vostro programma di confronto anche sui due files\u00a0<em>PROTEINA<em>tubercolosi_sensibile <\/em><\/em>e\u00a0<em>PROTEINA<em>tubercolosi_resistente.<\/em><\/em>\u00a0Le differenze che avete visto fra le sequenze nucleotidiche si traducono anche in differenze fra le proteine o no? <b>)<\/b><\/em><\/p>\n<h3>Cosa\u00a0potrebbero significare queste differenze?<\/h3>\n<p>Con i dati che avete ottenuto proviamo a fare insieme una\u00a0ipotesi su cosa sta succedendo. Ci\u00a0ragioniamo insieme<\/p>\n<h2>Cosa c&#8217;\u00e8 di vero in questa storia<\/h2>\n<h3>La resistenza dei batteri agli antibiotici, un problema reale<\/h3>\n<p><iframe loading=\"lazy\" src=\"\/\/www.youtube.com\/embed\/znnp-Ivj2ek?cc_load_policy=1&amp;hl=it\" width=\"560\" height=\"315\" frameborder=\"0\" allowfullscreen=\"allowfullscreen\"><\/iframe><\/p>\n<p>E&#8217; proprio utilizzando un metodo molto simile a quello che abbiamo descritto in questa esercitazione che si sono scoperte\u00a0l<a title=\"sito in inglese che riporta alcune delle resistenze caratterizzate\" href=\"http:\/\/amrls.cvm.msu.edu\/microbiology\/molecular-basis-for-antimicrobial-resistance\/acquired-resistance\" target=\"_blank\">e basi molecolari di alcuni casi comuni di resistenza batterica agli antibiotici<\/a>. Nel sito che vi ho lincato trovate una tabella che ne elenca alcuni divisi per tipologia.<\/p>\n<h3>La resistenza di\u00a0<em>Mycobacterium tuberculosis <\/em>agli antibiotici e la nuova ondata di vittime della tubercolosi<\/h3>\n<p>Il caso che abbiamo esaminato noi oggi, \u00e8 un caso reale di resistenza di\u00a0<em>Mycobacterium tuberculosis<\/em> alla Rifampicina\u00a0dovuto ad una mutazione puntiforme (cio\u00e8 di una singola base del DNA) nel gene che codifica per una proteina fondamentale per la sopravvivenza del batterio: la subunit\u00e0 B della RNA Polimerasi. L&#8217;antibiotico Rifampicina\u00a0si lega a questa proteina e ne blocca l&#8217;attivit\u00e0, cos\u00ec i batteri, senza una delle funzioni fondamentali per la sopravvivenza muoiono. Questa singola mutazione che abbiamo visto oggi (e ce ne sono altre note) impedisce alla Rifampicina\u00a0di legarsi alla subunit\u00e0 B della RNA Polimerasi ma non impedisce alla RNA Polimerasi di svolgere la sua funzione, quindi i batteri continuano a proliferare anche in presenza dell&#8217;antibiotico.<\/p>\n<p>Per approfondire sulla tubercolosi e per capire perch\u00e8 nella mia storia ho scelto proprio New York, potete consultare la <a title=\"tubercolosi wikipedia\" href=\"http:\/\/it.wikipedia.org\/wiki\/Tubercolosi\" target=\"_blank\">pagina di wikipedia dedicata a questa malattia<\/a>.<\/p>\n<h3>La\u00a0sequenza<\/h3>\n<p>La sequenza del gene per la &#8220;DNA-directed RNA polymerase subunit beta&#8221; di\u00a0<em><span class=\"highlight\">Mycobacterium tuberculosis<\/span> H37Rv\u00a0<\/em>(un ceppo virulento sensibile alla Rifampicina) che avete utilizzato in questa esercitazione\u00a0\u00e8 la vera sequenza ottenuta da studi sperimentali e\u00a0<a title=\"link alla fonte da cui arriva la sequenza\" href=\"http:\/\/www.ncbi.nlm.nih.gov\/gene\/888164\" target=\"_blank\">depositata nel database pubblico dell&#8217;NCBI<\/a>. La differenza che avete trovato \u00e8\u00a0una mutazione puntiforme realmente osservata in batteri che non rispondono all&#8217;antibiotico. Si tratta di\u00a0una delle mutazioni sequenziate\u00a0frequentemente nei\u00a0soggetti resistenti ed \u00e8 ampiamente studiata, \u00e8 nota come mutazione in posizione\u00a0531. Il resido in posizione 531\u00a0\u00e8 normalmente\u00a0una serina, ma nei mutanti viene sostituita da\u00a0un altro aminoacido. Il residuo 531 corrisponde\u00a0al 450-esimo residuo amminoacidico della sequenza che vi ho fornito e la vostra mutazione scambia una serina con\u00a0una prolina.<\/p>\n<h2>Cosa c&#8217;\u00e8 di falso\u00a0in questa storia<\/h2>\n<h3>La\u00a0sequenza &#8220;troppo perfetta&#8221;<\/h3>\n<p>Alcuni residui delle sequenza che vi ho fornito sono\u00a0stati modificati per rendervi possibile la ricerca delle sequenze promotoriali tipiche dei batteri e del sito di inizio della traduzione. La <a title=\"frammento di sequenza del genomico di M. tuberculosis\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/rpoB_genomico.txt\" target=\"_blank\">sequenza originale ottenuta dall&#8217;NCBI \u00e8 scaricabile a questo link<\/a>, mentre a questo secondo <a title=\"sequenza utilizzata per le esercitazioni\" href=\"https:\/\/sperimentando.com\/wp-content\/uploads\/2015\/04\/rpoB_genomico_mod.txt\" target=\"_blank\">link trovate la versione modificata<\/a>\u00a0(quella che avete utilizzato voi) in cui le basi cambiate sono indicate da lettere minuscole. Non tutti i geni batterici contengono tutte le sequenze canoniche che vi ho spiegato, a volte contengono una o pi\u00f9 varianti di queste, rendendo pi\u00f9 difficile l&#8217;identificazione del gene. Quello che avete imparato \u00e8 tutto giusto e molto utile, diciamo solo che le analisi reali sono un po&#8217; pi\u00f9 complicate di cos\u00ec, ma intanto avete fatto il primo passo!<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Il DNA \u00e8 un polimero organico costituito da monomeri chiamati nucleotidi. 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