Presentazione e contestualizzazione dell’attività
L’esperienza che presento in questo articolo è adatta agli studenti del V anno di una scuola di indirizzo tecnico chimico-biologico-biotecnologico oppure di un liceo che preveda l’insegnamento delle scienze per tutti i 5 anni di corso.
L’attività può essere proposta in una scuola di indirizzo tecnico allo scopo di presentare agli studenti le tecniche della PCR e dell’elettroforesi su gel, offrendogli un’opportunità per familiarizzare con le micropipette, con la gestione di piccoli volumi, con la gestione di un protocollo sperimentale e per imparare ad utilizzare macchinari comuni in un laboratorio biologico come il termociclatore, o la microcentrifuga o l’apparato da gel elettroforesi. Gli studenti eseguono anche un test di agglutinazione degli anticorpi per il riconoscimento del gruppo sanguigno di un campione di sangue sintetico. Questo è un esercizio utile, trattandosi di un test molto comune, che li abitua a lavorare in modo attento e preciso, ad osservare con attenzione i risultati sperimentali e a trarne interpretazioni e attribuzioni basandosi su conoscenze e/o tabelle di riferimento.
Sia nelle scuole tecniche che nei licei questo protocollo offre l’opportunità per far lavorare gli studenti sul concetto di identificazione di un individuo o di una specie in base al suo DNA, sulle implicazioni e potenzialità della tecnica della PCR per identificare, isolare ed amplificare segmenti di DNA in modo molto specifico tanto a scopo diagnostico quanto per l’ingegneria genetica.
L’attività prevede la risoluzione di un mistero nel quale sulla scena del crimine sono presenti campioni biologici come sangue, saliva e capelli della vittima e dell’assalitore. Si eseguono test per stabilire il gruppo sanguigno dei campioni ignoti e dei campioni dei sospettati e test di finger printing semplificato per comparare i campioni di DNA rinvenuti sulla scena del crimine con quelli della vittima e dei sospettati.
L’attività così come è descritta in questo articolo richiede due lezioni di circa due ore da svolgere in giorni distinti (anche consecutivi) e utilizza un kit per la PCR, un kit per l’analisi del DNA e un kit per la corsa elettroforetica.
Il mistero sul quale gli studenti devono indagare può essere presentato in vario modo a gusto dell’insegnante.
In questa pagina troverete:
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- una possibile introduzione al laboratorio per promuovere la riflessione sulla tecnica della pcr e del DNA fingerprinting
- i protocolli per preparare le due sessioni sperimentali (anche scaricabil in docx: giorno1 e giorno2 )
- i protocolli per eseguire gli esperimenti nelle due lezioni (anche scaricabil in docx: giorno1 e giorno2 ), un foglio risposte sul quale gli studenti annotano le proprie osservazioni e rispondono a domande (anche scaricabile in docx), un modulo di gradimento (anche scaricabile in docx), il testo di una possibile storia (anche scaricabile in docx)
- possibili collegamenti interdisciplinari
- alcune immagini dei risultati attesi
- qualche indicazione su dove acquistare il materiale e sul costo indicativo dell’esperienza
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Il DNA come un testo e le parole che distinguono un individuo dall’altro
E’ importante prima di iniziare un’attività sperimentale nella quale si identifica un individuo attraverso analisi del suo DNA che gli studenti riflettano sulle informazioni contenute nella sequenza di DNA, sul grado di similarità fra gli individui della nostra specie e sulla tipologia di risposte che può darci una tecnica come il DNA fingerprinting. In modo particolare è interessante che riflettano anche sulle diverse potenzialità del taglio di restrizione e della selezione di tratti di sequenza per PCR. Per questa ragione è consigliabile dedicare la prima mezz’ora ad una attività di laboratorio virtuale come quella descritta in questo post. Solo dopo aver lavorato su carta gli studenti possono cominciare a mettere le mani sugli enzimi, avendo di fatto chiaro in testa cosa stanno facendo.
Preparazione del materiale:
Giorno 1 (scarica giorno1.docx)
Materiale necessario per 6 postazioni (escluso quello gia’ nel kit biorad Crime Scene Investigator PCR Basics™ Kit)
- Termociclatore
- 6 scatole con ghiaccio o blocchetti termici a temperature da frigo
- 6 pipette utili a prelevare 20 μl
- 6 scatole di punte per pipette da 2-20 μl (anche non piene) – non servono sterili
- 6 bicchieri per gli scarti
- 1 pipetta da 20-200 μl
- 1 scatola di punte da 20-200 μl
- 1 pipetta da 200-1000 μl
- 1 scatola di punte da 200-1000 μl (anche non piena)
- 7 pennarelli indelebili
- (una centrifuga per tubini se c’è disponibile)
Preparazione delle aliquote per 6 postazioni
- Scongelare e poi mettere in ghiaccio:
- la master mix 2X fornita con il kit (circa 720μl)
- il mix di primer
- i vari campioni di DNA
- Scrivere su 6 tubi gialli “reagenti per PCR” Scrivere su 6 tubi viola “DNA Scena del crimine”
Scrivere su 6 tubi verde “DNA Sospetto A”
Scrivere su 6 tubi blu “DNA Sospetto B”
Scrivere su 6 tubi arancio “DNA Sospetto C”
Scrivere su 6 tubi rosa “DNA Sospetto D” - Preparare la master mix:
- Mettere in uno dei 6 tubi gialli marcati “reagenti per PCR” 720 μl di PCR mix
- Aggiungere 14,4 μl di primer mix
- Mescolare bene
- Trasferire 120 μl di mix in ciascuno degli altri tubini gialli marcati “reagenti per PCR”
- Mettere i tubi in ghiaccio o in frigo
- Aliquotare il DNA: Trasferire 25 μl di ciascun tipo di DNA nel corrispondente tubino marcato e colorato; Mettere i tubi in ghiaccio o in frigo
Materiale da distribuire su ciascuna delle 6 postazioni
- un pennarello indelebile a punta fine
- una micropipetta adatta a prelevare un volume di 20 μl
- punte per la micropipetta
- una scatolina in polistirolo contenente ghiaccio o un blocco termico a 4-8°C, contenenti:
- 120 μl di reagenti per PCR (liquido blu)
- 25 μl di DNA estratto dalla scena del crimine (tubo viola)
- 25 μl di DNA del sospetto A (tubo verde)
- 25 μl di DNA del sospetto B (tubo blu)
- 25 μl di DNA del sospetto C (tubo arancio)
- 25 μl di DNA del sospetto D (tubo rosa)
- 5 tubini per PCR chiusi
- 5 adattatori per i tubini da PCR
- un bicchiere per gli scarti (punte e tubini)
Giorno 2 (scarica giorno2.docx)
Materiale necessario per 6 postazioni
- 1 alimentatore
- una centrifuga per tubini
- 1 macchina per flashgel
- 3 flashgel gel precast lonza (agarosio 2,2%)
- 6 blocchetti termici a temperature da frigo
- 6 pipette utili a prelevare 2-20 μl o 20-200 μl
- 6 scatole di punte per le pipette – non servono sterili
- 6 bicchieri per gli scarti
- 1 pipetta da 200-1000 μl
- 1 scatola di punte da 200-1000 μl (anche non piena)
- 7 pennarelli indelebili
- tubini colorati avanzati dal kit + una busta di tubini trasparenti
- almeno 6 portatubini a temperatura ambiente
- piastre e stecchini del kit per la tipizzazione del sangue
Preparazione delle aliquote per 6 postazioni
- Aliquotare il sangue sintetico:
- Scrivere su 6 tubi gialli “sangue della vittima”
- Scrivere su 6 tubi viola “sangue Scena del Crimine”
- Scrivere su 6 tubi verde “sangue Sospetto A”
- Scrivere su 6 tubi blu “sangue Sospetto B”
- Scrivere su 6 tubi arancio “sangue Sospetto C”
- Scrivere su 6 tubi rosa “sangue Sospetto D”
- Mettere in ciascuno dei tubi gialli (V) 160 μl di sample 4
- Mettere in ciascuno dei tubi viola (SC) 100 μl di sample 3
- Mettere in ciascuno dei tubi verdi (A) 160 μl di sample 1
- Mettere in ciascuno dei tubi blu (B) 160 μl di sample 2
- Mettere in ciascuno dei tubi arancio (C) 160 μl di sample 3
- Mettere in ciascuno dei tubi rosa (D) 160 μl di sample 3
- Aliquotare gli antisieri
- Scrivere su 6 tubi blu “anticorpi anti A”
- Scrivere su 6 tubi gialli “anticorpi anti B”
- Scrivere su 6 tubi trasparenti “anticorpi anti Rh+”
- Aliquotare 500 μl di ciascun antisiero nei tubini corrispondenti
- Aliquotare il loading dye:
- Scrivere su 6 tubini “liquido di caricamento denso 5X”
- Mettere in ciascuno dei 6 tubini 50 μl di orange loading dye 5X
- Aliquotare il ladder:
- Scrivere su 6 tubini “riferimento”
- Mettere in ciascuno dei 6 tubini 25 μl di allele ladder
Materiale da distribuire su ciascuna delle 6 postazioni
- Un protocollo e un foglio risposte
- un pennarello indelebile a punta fine
- una micropipetta ogni 2 gruppi adatta a prelevare un volume di 20-200 μl
- una micropipetta ogni 2 gruppi adatta a prelevare un volume di 2-20 μl
- punte per le micropipette
- un portatubini a temperatura ambiente contenente:
- un piccolo campione di sangue raccolto sulla scena del crimine (tubo viola)
- 160 μl di sangue della vittima (tubo giallo)
- 160 μl di sangue del sospetto A (tubo verde)
- 160 μl di sangue del sospetto B (tubo blu)
- 160 μl di sangue del sospetto C (tubo arancio)
- 160 μl di sangue del sospetto D (tubo rosa)
- 500 μl di soluzione di anticorpi contro il gruppo sanguigno A (tubo e liquido blu)
- 500 μl di soluzione di anticorpi contro il gruppo sanguigno B (tubo e liquido giallo)
- 500 μl di soluzione di anticorpi contro il fattore Rh+ (tubo e liquido trasparente)
- 6 piastre per le reazioni di tipizzazione del sangue
- 6 stecchini blu
- 6 stecchini gialli
- 6 stecchini bianchi
- un portatubini a temperatura compresa fra 0-10°C contenente:
- liquido di caricamento denso 5X (tubo trasparente, liquido arancione)
- Soluzione di rifermento (allele ladder)
- PCR sul campione di DNA rinvenuto sulla scena del crimine SC
- PCR sul campione di DNA del sospetto A
- PCR sul campione di DNA del sospetto B
- PCR sul campione di DNA del sospetto C
- PCR sul campione di DNA del sospetto D
- 6 tubini trasparenti senza tappo
- un contenitore per gli scarti (punte e tubini)
Protocollo sperimentale, materiale di supporto e schede di verifica dell’apprendimento:
Il primo giorno di attività prevede l’introduzione all’identificazione di un individuo attraverso lo studio di tratti del suo DNA con il laboratorio virtuale (link al materiale per il laboratorio virtuale), quindi si procede con l’allestimento della PCR su una serie di campioni di potenziali sospetti e di materiali raccolti sulla scena del delitto (protocollo del primo giorno di laboratorio) e gli studenti iniziano a riflettere sulle domande 1-4 del foglio risposte, anche discutendone fra di loro.
Il secondo giorno gli studenti leggono la storia (questo è il testo di un possibile racconto), quindi procedono con il test dei gruppi sanguigni sui campioni recuperati dalla scena del crimine e sui campioni di vittima e sospettati (protocollo del secondo giorno di laboratorio). Per attribuire correttamente il gruppo sanguigno a ciascun campione gli studenti possono utilizzare questo materiale didattico suppletivo sui gruppi sanguigni che l’insegnante avrà introdotto e illustrato. Il risultato degli esperimenti verrà annotato sul foglio risposte. Dopo aver effettuato questo primo test gli studenti recuperano le PCR dal termociclatore, le preparano per la corsa su gel aggiungendo il colorante e la soluzione di caricamento e quindi le caricano in gel elettroforesi (protocollo del secondo giorno di laboratorio). Dopo la corsa (che dura circa 5 minuti) gli studenti fotografano i propri risultati sperimentali con il cellulare e rappresentano graficamente i risultati sul foglio risposte. A questo punto saranno pronti per riportare sul foglio risposte il nome del colpevole e le evidenze che supportano la loro conclusione, inoltre avranno il tempo di compilare le risposte alle domande 1-4 del foglio risposte.
Al termine dell’attività, è sempre una buona abitudine distribuire un questionario per valutare il gradimento dei ragazzi. Gli studenti con i quali ho affrontato questo laboratorio hanno dato giudizi estremamente positivi sull’esperienza ed hanno dimostrato sia con gli esperimenti che con le risposte alle domande di verifica di aver raggiunto pienamente la gran parte degli obiettivi di apprendimento (le domande 3 e 4 sono risultate ovviamente le più difficili). Tuttavia non va sempre così, e leggere i commenti dei ragazzi è sempre utile per migliorare i protocolli e adattare le esperienze di apprendimento alle esigenze dello specifico gruppo di studenti. Molti protocolli si dimostrano soldi su ampi gruppi di utenti, altri devono essere proposti in modo diverso in contesti diversi (qualcuno a volte va anche cestinato, ma in questi casi l’esperienza non viene proposta su questo sito 😉 ).
Possibili collegamenti interdisciplinari:
Questa attività suggerisce un ovvio collegamento con il diritto penale e con l’uso forense delle evidenze biologiche sulla scena del crimine. Se avete colleghi di diritto curiosi e volenterosi possono proporre una lezione critica sull’uso di questo tipo di prove nella recente storia del diritto oppure articolare una lezione su casi curiosi in cui l’analisi del DNA ha dato una svolta essenziale o inaspettata, infine potrebbero allestire con i ragazzi un finto processo proprio costruito sulla storia che avete proposto durante il laboratorio di scienze. Io sono stata fortunata ed una brava collega di diritto ha intrattenuto i miei studenti per due ore. I ragazzi erano molto interessati ed hanno dato giudizi estremamente positivi sull’esperienza, per cui vale la pena tentare!
Cosa ci aspettiamo da questi esperimenti:
[work in progress]Come e dove acquistare il materiale necessario:
Questa esercitazione è stata organizzata utilizzando:
- biorad Crime Scene Investigator PCR Basics™ Kit che contiene tutti i reagenti e i campioni di DNA per fare un riconoscimento di identità fra un campione ignoto e una collezione di potenziali sospettati basato sull’amplificazione per PCR. Per portare avanti le attività di questo protocollo è pertanto necessario che la scuola disponga di un termociclatore. In caso contrario si possono acquistare dal CusMiBio di Milano collezioni di campioni di DNA già amplificati da correre in gel elettroforesi. I ragazzi non fanno la PCR ma possono comunque analizzare i risultati in gel elettroforesi.
- l’elettroforesi su gel di agarosio è stata effettuata utilizzando il sistema flash gel di Lonza, che consente di tenere tutti i reagenti potenzialmente tossici e mutageni lontani dagli studenti in totale sicurezza e che impiega pochi minuti a correre (risultando così compatibile con i tempi stretti della didattica). Per questo protocollo è necessario che la scuola disponga di un generatore di corrente e di una macchina per elettroforesi su flash gel che ha il transilluminatore integrato. I singoli gel prefatti usa e getta possono essere acquistati in pacchi di 10. Anche in questo caso, se la scuola non dispone del macchinario necessario è possibile affittare il sistema flashgel dal CusMiBio di Milano.
- Infine di kit per l’identificazione dei gruppi sanguigni ne esistono molti e vengono distribuiti da tutti i fornitori di materiali per la didattica in Italia e all’estero. A me piace in modo particolare il kit distribuito da Carolina negli Stati Uniti, perchè i reagenti sono in quantità abbondante, il risultato è chiaro ed esteticamente perfetto. Purtroppo per ricevere questo kit in Italia bisogna sostenere spese e disagi di sdoganamento e trasporto.. pertanto può essere un’idea pratica ripiegare su un qualsiasi altro fornitore più comodo. Peccato che non ci sia una Carolina in Italia (non solo per questo kit!)
